1 维生素 K2 的测定

1.1 检验依据

本方法参考卫生计生委 2016 年公告（ 2016 年第 8 号） “ 维生素 K₂ （发酵法） ” 规定的方法来检测。

1.2 原理

试样中的维生素 K₂ 用 异丙醇提取，采用高效液相色谱仪分离检测，紫外检测，外标法定量。

1.3 试剂

本方法要求所用试剂和水，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和 GB/T 6682 中规定的一级水。

1.3.1 异丙醇。

1.3.2 甲醇：色谱纯。

1.3.3 维生素 K₂ 标准品（七烯甲萘醌， MK-7 ）：纯度 ≥ 95% ，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

1.3.4 维生素 K₂ 标准储备溶液：精密称取一定量七烯甲萘醌标准品，用异丙醇溶解并定容，配制成浓度为 10 μg/mL 的标准储备溶液。

1.3.5 维生素 K₂ 标准工作液：将维生素 K₂ 标准储备溶液用异丙醇稀释成系列标准溶液，浓度分别为 0 、 0.5 、 1 、 2 、 5 和 10μg/mL 。

1.4 仪器和设备

1.4.1 高效液相色谱仪，配备紫外光检测器：可变波长。

1.4.2 分析天平：精确度为 0.1 mg 。

1.4.3 超声提取仪。

1.5 试验步骤

1.5.1 试样的准备

精密称取混合均匀的试样约 2.0g （精确至 0.001g ）于 10mL 容量瓶中，加入异丙醇超声提取 30min ，定容至刻度，摇匀，过 0.45μm 滤膜，待上机测定。

1.5.2 参考色谱条件

色谱柱： C₁₈ ODS 柱，柱长 150 mm ，内径 4.6mm ，内装 C₁₈ 填充物，粒径 5μm ，或性能相当者。

流动相：甲醇

流速： 1.0mL/min 。

柱温： 50 ℃ 。

检测波长： 254nm 。

进样量： 10μL 。

1.5.3 标准曲线的制作

    将不同浓度的维生素 K₂ 标准工作液（ 1.3.5 ）分别按参考色谱条件（ 1.5.2 ）进行测定，得到相应的标准工作液的色谱峰面积。以维生素 K₂ 标准工作液的浓度为横坐标，以色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.5.4 试验数据处理

将试样溶液（ 1.5.1 ）按参考色谱条件（ 1.5.2 ）进行测定，得到相应的试样溶液的色谱峰面积。根据标准曲线得到待测试样溶液中维生素 K₂ 的浓度，平行测定次数不少于两次。样品中维生素 K₂ 的含量，以微克每百克（ μg/g ）表示，按式（ 1 ）计算：

X = c × V / m………………………………………… （ 1 ）

式中：

X —— 试样中维生素 K₂ 的含量， μg /g ；

c —— 由标准曲线得出的试样溶液中维生素 K₂ 的浓度， μg/mL ；

V —— 试样稀释定容体积， mL ；

m —— 试样称取的质量， g 。

试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于算术平均值的 10 % 。