1 钙的测定

1.1 原理：在适当的pH范围内，钙与EDTA（乙二胺四乙酸二钠）形成金属络合物。以EDTA滴定，在达到当量点时，溶液呈现游离指示剂的颜色。根据EDTA用量计算钙的含量。

1.2 试剂

1.2.1 氢氧化钠（NaOH）: 1 mol/L

1.2.2 乙二胺四乙酸二钠（EDTA）: 0.05 mol/L

1.2.3 盐酸（HCl）: 3 mol/L

1.2.4 羟基萘酚蓝指示剂

1.2.5 去离子水

1.3 仪器

1.3.1 分析天平

1.3.2 马弗炉

1.4 样品处理 (一式两份)：

取不少于20片本品，精密称定，计算每片平均重量，研细。精密称取相当于碳酸钙约200mg（大约325mg粉末），转移至适当的瓷坩埚，在800±25°C下灼烧2个小时。冷却，边搅拌边加10mL水，随后向坩埚中滴加2mL的盐酸溶液（3mol/L）使残渣溶解，加热坩埚，使残渣完全溶解。

1.5 样品测定：

用水将样品溶液移至250mL锥形瓶中，用水稀释至150mL，加15mL的氢氧化钠溶液(1mol/L)，加羟基萘酚蓝指示剂少许，用EDTA溶液（0.05mol/L）滴定至溶液变为深蓝色。

1.6 结果计算

式中：

X—样品中钙的含量，mg/片；

V—EDTA消耗的体积，ml；

F—EDTA浓度校正因子；

5.004—EDTA滴定度，mg/mL，每毫升0.05mol/L EDTA溶液相当于5.004mg的碳酸钙；

AWD—单位剂量的平均重量，mg；

40.078—钙的相对原子质量；

M—取样量，mg；

100.09—碳酸钙的相对分子质量。

2 维生素D₃的测定

2.1 原理：试样中的维生素D₃，经正己烷提取，用高效液相色谱仪分析，采用外标法定量。

2.2 试剂

2.2.1 二甲基亚砜（DMSO）

2.2.2 二丁基羟基甲苯（BHT）

2.2.3 色谱纯正己烷

2.2.4 色谱纯异丙醇

2.2.5 去离子水

2.2.6 标准品来源纯度：维生素D₃标准品，纯度>98%。

2.3 仪器

2.3.1 分析天平

2.3.2 高效液相色谱仪：带UV或PDA检测器

2.3.3 离心机

2.3.4 水浴锅

2.3.5 超声仪

2.4 试液配制

注意：由于维生素D₃对光敏感，对照品溶液及供试品溶液制备过程中，需使用棕色玻璃器皿或者使用透明容器时用铝箔包裹。

2.4.1 DMSO溶液的制备：量取10份DMSO与2份水，混合均匀，冷却至室温。

2.4.2 溶剂溶液的制备：精密称取800mg BHT加入到4L DMSO溶液中，混匀溶解得到含0.02% BHT的DMSO溶液。

2.4.3 提取液的制备：精密称取BHT 800mg加入到4L正己烷溶解，混匀溶解得到含0.02% BHT的正己烷溶液。

2.4.4 流动相的制备：量取99份正己烷与1份异丙醇，混合均匀。

2.4.5 对照品溶液的制备（一式两份，一份为工作对照品溶液，一份为工作检测对照品溶液）：

精密称取维生素D₃对照品25.0mg于100mL棕色容量瓶中，加入75mL提取液，超声溶解15分钟，并时时振摇至完全溶解，保持超声水温不超过30ºC。从超声仪取出，加入提取液稀释至刻度，摇匀，此为维生素D₃对照品贮备液1，维生素D₃浓度为250μg/mL。用移液管精密吸取5.0mL维生素D₃对照品贮备液1，置50mL棕色容量瓶中，用提取液稀释至刻度，此为对照品贮备液2，维生素D₃浓度为25μg/mL。再用移液管精密吸取2.0mL维生素D₃对照贮备液2，置50mL棕色容量瓶中，加入提取液稀释至刻度，制成每1mL中含维生素D₃约1μg的对照品溶液。

2.4.6 系统适应性溶液的制备：

取浓度为1μg/mL维生素D₃工作对照品溶液10mL在60ºC水浴中加热1小时后，放冷至室温，使维生素D₃部分异构化成相应的前体。

2.5 样品处理（一式两份）

取本品25片，计算每片平均重量，研细，使用凹槽较深的药匙取样，取样时不要抖落样品，精密称取5161.3mg±10%(约相当于维生素D₃ 25 µg），置于100mL棕色容量瓶中，加溶剂溶液50mL，超声震荡约15分钟，并时时振摇，保持超声水温不超过30ºC，精密加入提取液25.0mL，振摇15分钟。在转子半径为10厘米和转速为4000转/分钟或等同的条件下（RCF≥1789）离心溶液5分钟，使溶液分层。取上清溶液，转移至另一个棕色容量瓶中，避光静置1小时后的澄清溶液作为供试品溶液。

注：RCF(相对离心力)=11.18×r×(Q/1000)²，

其中r =转子半径（cm）和Q⁽¹⁾= 转/分钟。

^（1）求解转子半径（r）的最小转速，

2.6 样品测定

2.6.1 色谱条件：

流速： 1.5mL/min

波长：265nm

HPLC色谱柱： Waters NH₂ 250mm×4.6mm 或相似色谱柱

柱温： 室温

进样量：100μl

2.6.2 系统适应性：

注射至少1针提取液，确认提取液对维生素D₃峰无影响。注射1针系统适应性溶液，5针工作对照品溶液和3针工作检测对照品溶液。系统适应性要求如下（包括工作对照品比较）：

分离度： 不小于5

拖尾因子：不大于2.0

标准品比较因子：不小于0.98且不大于1.02

理论塔板数：不小于5000

2.6.3 如果符合系统适应性要求，注射供试品溶液各2针。每20针或更少或每不超过4小时样品运行注射工作对照品溶液，所有的样品需要被工作对照品溶液包围。所有进样标准品的RSD%应不大于2%。

2.7 结果计算

式中：

X—样品中维生素D₃的含量，μg/片；

Ru—供试品溶液中维生素D₃的平均峰面积；

Rs—5针维生素D₃工作对照品溶液中维生素D₃的平均峰面积；

P—维生素D₃对照品纯度；

Std. Wt.—维生素D₃对照品的重量，mg；

Spl. Wt.—样品重量，mg；

AWD—25片单位剂量的平均重量，mg；

1.09—维生素D₃的校正因子。

3 维生素K₂的测定

3.1 原理：试样中的维生素K₂，经四氢呋喃与无水乙醇提取，用高效液相色谱仪分析，采用外标法定量。

3.2 试剂

3.2.1 色谱纯无水乙醇

3.2.2 色谱纯四氢呋喃

3.2.3 去离子水

3.2.4 标准品来源纯度：维生素K₂ (七烯甲萘醌) 标准品，纯度>98%。

3.3 仪器

3.3.1 分析天平

3.3.2 高效液相色谱仪：带UV或PDA检测器

3.3.3 涡旋仪

3.4 试液配制

注意：由于维生素K₂对光敏感，对照品溶液及供试品溶液制备过程中，需使用棕色玻璃器皿或者使用透明容器时用铝箔包裹。

3.4.1 流动相的制备：量取97份无水乙醇与3份去离子水，混合均匀，再通过0.45μm膜过滤。

3.4.2 对照品溶液的制备（一式两份，一份为工作对照品溶液，一份为工作检测对照品溶液）：

精密称取七烯甲萘醌对照品25.0mg于250mL低光化性容量瓶中。移入5.0mL四氢呋喃与约125mL无水乙醇。然后，涡旋样品1分钟以混匀对照品溶液。稀释至刻度，混匀，得到浓度为100μg/mL的对照品储备液。移取2.0mL对照品储备液于100mL低光化性容量瓶中。用无水乙醇稀释至刻度，混匀，得到浓度为2.0μg/mL的工作对照品溶液。通过0.45μm注射器式滤器过滤。

3.5 样品处理 (一式两份)

收集本品至少20片，准确称重，计算单位剂量平均重量。称取约4000.0mg±10%物料，置于100 mL低光化性容量瓶中。移入8.0mL四氢呋喃，加入约50mL无水乙醇。通过涡旋混合样品1分钟。用无水乙醇稀释至刻度，混匀。通过0.45μm注射器式滤器过滤。

3.6 样品测定

3.6.1 色谱条件：

流速： 0.7mL/min

波长：268nm

HPLC色谱柱：Kinetex c18 4.6mm×100mm；2.6μm粒度

柱温： 室温

进样量：10μl

3.6.2 系统适应性：注射2%四氢呋喃的无水乙醇溶液作为空白至少1针，确认对维生素K₂峰无显著影响。注射5针工作对照品溶液和3针工作检测对照品溶液。

系统适应性要求如下（包括工作对照品比较）：

标准品比较因子：不小于0.97且不大于1.03

RSD%：不大于2.0%

3.6.3 如果符合系统适应性要求，注射供试品溶液各2针。每20针或更少或每不超过4小时样品运行注射工作对照品溶液，所有的样品需要被工作对照品溶液包围。所有进样标准品的RSD%应不大于2%。

3.7 结果计算

式中：

X—样品中维生素K₂的含量，μg/片；

Ru—供试品溶液中维生素K₂的平均峰面积；

Rs—5针工作对照品溶液中维生素K₂的平均峰面积；

P—维生素K₂对照品纯度；

Std. Wt.—维生素K₂对照品重量，mg；

Spl. Wt.—样品重量，mg；

AWD—收集的片子的单位剂量的平均重量，mg。